Elektroforesis

I. JUDUL PERCOBAAN : ELEKTROFORESIS

II. TUJUAN PERCOBAAN :

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui cara melakukan analisis protein dengan teknik SDS-PAGE dan memperkirakan berat molekul komponen dalam sampel. 

III. TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis pertama kali dicetuskan oleh virologiwan yang bernama Vin Thorne dari Institut Virologi Glasgow. Thorne tertarik untuk menemukan cara yang paling efektif dalam analisis hasil amplifikasi DNA. Thorne beranggapan bahwa sumber listrik mampu memisahkan molekul-molekul DNA berdasarkan ukurannya. Hal tersebut didasarkan juga pada sifat DNA yang bemuatan negatif. Thorne berhasil memisahkan superhelical nicked dan bentuk linear dari DNA poliomavirus dengan menggunakan gel agar . 

Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis. (Anonym b, 2010) Dasar elekroforesis adalah pembentukkan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-seyawa yang telah terpisah  tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. 

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.  

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.

Elektroforesis memisahkan makromolekul berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel akan memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.

IV. ALAT DAN BAHAN:

Alat:

1.      Alat-alat gelas pyrex

2.      Pipet

3.      Neraca elektrik

4.      Batang pengaduk

5.      Rotari evaporator eyela N-1000

6.      Alat elektroforesis PAGE

7.      Sentrifuge

8.      Spektrofotometer

9.      Plate

Bahan :

1.      Sampel protein (susu full cream)

2.      Coomassie brilian blue

3.      1 molar Tris-HCL (pH 6,8)

4.      Glisrrol 50 %

5.      SDS 10 %

6.      2 mercaptoetanol

7.      Amonium sulfat

8.      Etanol 95 %

9.      Asam fosfat 85 %

10.  Bromofenol blue 1 %

11.  Larutan solution A

12.  Larutan solution B

13.  Amonium persulfat 10%

14.  TEMED

15.  Methanol

16.  Asam asetat glasial

17.  Aquades

V. METODE PERCOBAAN

Pengendapan protein

Sampel sebanyak 150 mL ditambahkan dengan 47 gram amonium sulfat, kemudian diaduk hingga bercampur rata. Setelah itu, sampel di sentrifuge.

1. Penentuan konsentrasi protein dengan metode Bradford.

a. Pembuatan larutan.

 Reagen Bradford dibuat dengan cara mencampurkan 0,025 gram Coomassie Brilliant Blue dalam 12,5 mL etanol 95 %. Kemudian ditambahkan dengan 12,5 mL larutan asam fosfat 85 %. Selanjutnya, ditambahkan dengan aquades sampai volume total menjadi 250 mL.

b. Penentuan konsentrasi protein dalam sampel.

Reagen Bradford sebelum digunakan, disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring. Setelah itu, 50 μL sampel ditambahkan dengan 2,5 mL reagen Bradford, selanjutnya, larutan dibaca absorbansinya pada λ = 595 nm.

Denative PAGE

a. pembuatan sampel buffer untuk ditambahkan pada sampel yang akan dirunning.

0,6 mL Tris-HCL 1M (pH 6,8) ditambahkan 5 mL gliserol 50 %, 2 mL SDS 10 %, 0,5 mL 2-mercaptoethanol, 1 mL bromophenol blue dan 0,9 mL aquades. Selanjutnya, 250 μL sampel buffer ditambahkan pada 50 μL sampel protein. Kemudian, dipanaskan selama ± 30 menit.

b. Pembuatan larutan gel PAGE.

2,7 mL solution A ditambahkan dengan 2,5 mL solution B dan 4,8 mL H₂O. Selanjutnya ditambahkan dengan 50 μL amonium persulfat dan 5 μL TEMED (penambahan kedua bahan tersebut dilakukan setelah alat selesai dirangkai).

c. Running gel PAGE.

Larutan gel elektroforesis dimasukkan dalam wadah kaca fan dibuat rapi agar larutan tidak meluber, kemudian ditutup dengan menggunakan sisir. Ditunggu beberapa menit (± 5-10 menit), dilihat apakah larutan tadi sudah berbentuk gel atau tidak. Apabila gel telah terbentuk sisir diangkat, kemudian ge siap dirunning. Larutan buffer diisi pada tempatnya dan sampel protein dimasukkan ke dalam celah-celah yang terbentuk pada gel. Gel dirunning pada tegangan 20 mA dan selama ± 1 jam.

d. Staining dan destaining gel PAGE

Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel dan larutan destaining untuk pencucian atau menghilangkan warna pada gel dan memperjelas band protein yang terbentuk.

a)      Larutan staining 250 mL dibuat dengan mencampurkan 0,25 gram Coomasie Brilliant Blue, 112,5 mL metanol, 112,5 mL aquades dan 25 mL asam asetat glasial.

b)      Larutan destaining 500 mL dibuat dengan mencampurkan 50 mL metanol, 50 mL asam asetat glasial dan 400 mL aquades.

Selanjutnya gel direndam di dalam 20 mL larutan staining solution sambil digoyang selama 20 menit, kemudian larutan staining dituang kembali lewadahnya. Kemudian gel direndam dalam larutan destaining selama 20 menit dan dicuci selama 3x.

VI. HASIL PERCOBAAN.

50 mL sampel protein + 2,5 mL bradford dicampur menjadi warna biru tua dan  diukur dalam spektovisible 0,645 A 595 hm

Perbandingan 1:5

Sampel: sampel buffer.

Dibuat 4 larutan

1. Tabung berisi susu.

2. Tabung berisi susu.

3. Tabung berisi susu.

4. Tabung berisi nira.

Keempat tabung dipanaskan dimasukkan pada kolom pada elektroforesis 20 Ma dibiarkanselama ½ jam. Hasil dalam gel dicuci dengan larutan desteaning. Didiamkan selama 5 menit 

VII. PEMBAHASAN

Dari pengamatan yang kami lakukan, cara kerja metode elktroforesis adalah sebagai berikut:

 

1. Ektraksi enzim

Setelah sampel dibersihkan ditempatkan didalam mortal dan diberi pengestrak sebanyak ± 200 (tergantung dari banyaknya, sedikitnya sampel atau besar kecilnya sampel) kemudian smpel digerus hingga halus. Penggerusan dilakukan pada kondisi dingin (± 4 0C) dan dilakukan didalam meja pendingin. Agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan kedalam tabung eppendrof dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan yang selanjutnya dimasukkan dalam tabung eppendof yang disimpan dalam lemari pendingin (freezer) dalam suhu sekitar 70 0C.

2. Pembuatan gel

Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elktroforesis pada erlenmeyer, kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan

3. Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak enzim. Ekstar enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipt mikro. Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indicator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

4. Proses Elektroforesis

Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan anatar larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elekrofororsis dijalankan dengan member daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50-70 A, 50-60 A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam. Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.

5. Visualisasi sistem enzim

Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang telah ditentukan sebelumnya. Atau dapat pula dilakukan dengan pancaran sinar Ultraviolet.

6. Metode Analisis

Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yang ada dalam suatu populasi.

VIII. KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan :

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.

Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah: 1) Ektraksi enzim, 2) Pembuatan gel, 3) Penempatan sampel, 4) Proses Elektroforesis, 5) Visualisasi system enzim dan 6) Metode Analisis.

Saran :

Saran pada praktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan sendiri dan dilkukan proses elektroforesis yang sebenarnya supaya praktikan lebih mengetahui cara menggunakan metode elektroforesis.