I. JUDUL PERCOBAAN
: ELEKTROFORESIS
II. TUJUAN PERCOBAAN :
Praktikum ini
bertujuan untuk mengetahui cara melakukan analisis protein dengan teknik
SDS-PAGE dan memperkirakan berat molekul komponen dalam sampel.
III. TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis pertama kali dicetuskan oleh virologiwan yang
bernama Vin Thorne dari Institut Virologi Glasgow. Thorne tertarik untuk
menemukan cara yang paling efektif dalam analisis hasil amplifikasi DNA. Thorne
beranggapan bahwa sumber listrik mampu memisahkan molekul-molekul DNA
berdasarkan ukurannya. Hal tersebut didasarkan juga pada sifat DNA yang bemuatan
negatif. Thorne berhasil memisahkan superhelical nicked dan bentuk linear dari
DNA poliomavirus dengan menggunakan gel agar .
Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan
molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan
kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Elektroforesis
gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam
bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan
kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya.
Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan
muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis.
(Anonym b, 2010) Dasar elekroforesis adalah pembentukkan suatu ketidakhomogenan
atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan
mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan
untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila
senyawa-seyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali
akibat sirkulasi konvektif.
Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan
mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis
adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan
molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam
medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul
protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub
negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan
disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE =
Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi
akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA
atau protein dengan ukuran lebih besar.
Elektroforesis memisahkan makromolekul berdasarkan laju
perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel akan memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita
yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.
IV. ALAT DAN BAHAN:
Alat:
1.
Alat-alat gelas
pyrex
2.
Pipet
3.
Neraca elektrik
4.
Batang pengaduk
5.
Rotari
evaporator eyela N-1000
6.
Alat
elektroforesis PAGE
7.
Sentrifuge
8.
Spektrofotometer
9.
Plate
Bahan :
1.
Sampel protein
(susu full cream)
2.
Coomassie
brilian blue
3.
1 molar
Tris-HCL (pH 6,8)
4.
Glisrrol 50 %
5.
SDS 10 %
6.
2
mercaptoetanol
7.
Amonium sulfat
8.
Etanol 95 %
9.
Asam fosfat 85
%
10. Bromofenol blue
1 %
11. Larutan
solution A
12. Larutan
solution B
13. Amonium
persulfat 10%
14. TEMED
15. Methanol
16. Asam asetat
glasial
17. Aquades
V. METODE PERCOBAAN
Pengendapan protein
Sampel sebanyak 150 mL ditambahkan
dengan 47 gram amonium sulfat, kemudian diaduk hingga bercampur rata. Setelah
itu, sampel di sentrifuge.
1. Penentuan
konsentrasi protein dengan metode Bradford.
a. Pembuatan
larutan.
Reagen
Bradford dibuat dengan cara mencampurkan 0,025 gram Coomassie Brilliant Blue
dalam 12,5 mL etanol 95 %. Kemudian ditambahkan dengan 12,5 mL larutan asam
fosfat 85 %. Selanjutnya, ditambahkan dengan aquades sampai volume total
menjadi 250 mL.
b. Penentuan
konsentrasi protein dalam sampel.
Reagen Bradford
sebelum digunakan, disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring. Setelah
itu, 50 μL sampel ditambahkan dengan 2,5 mL reagen Bradford, selanjutnya,
larutan dibaca absorbansinya pada λ = 595 nm.
Denative PAGE
a. pembuatan
sampel buffer untuk ditambahkan pada sampel yang akan dirunning.
0,6 mL Tris-HCL
1M (pH 6,8) ditambahkan 5 mL gliserol 50 %, 2 mL SDS 10 %, 0,5 mL
2-mercaptoethanol, 1 mL bromophenol blue dan 0,9 mL aquades. Selanjutnya, 250
μL sampel buffer ditambahkan pada 50 μL sampel protein. Kemudian, dipanaskan
selama ± 30 menit.
b. Pembuatan
larutan gel PAGE.
2,7 mL solution
A ditambahkan dengan 2,5 mL solution B dan 4,8 mL H2O. Selanjutnya
ditambahkan dengan 50 μL amonium persulfat dan 5 μL TEMED (penambahan kedua
bahan tersebut dilakukan setelah alat selesai dirangkai).
c. Running
gel PAGE.
Larutan gel
elektroforesis dimasukkan dalam wadah kaca fan dibuat rapi agar larutan tidak
meluber, kemudian ditutup dengan menggunakan sisir. Ditunggu beberapa menit (±
5-10 menit), dilihat apakah larutan tadi sudah berbentuk gel atau tidak.
Apabila gel telah terbentuk sisir diangkat, kemudian ge siap dirunning. Larutan
buffer diisi pada tempatnya dan sampel protein dimasukkan ke dalam celah-celah
yang terbentuk pada gel. Gel dirunning pada tegangan 20 mA dan selama ± 1 jam.
d. Staining
dan destaining gel PAGE
Untuk tahap ini
diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel dan larutan
destaining untuk pencucian atau menghilangkan warna pada gel dan memperjelas
band protein yang terbentuk.
a) Larutan
staining 250 mL dibuat dengan mencampurkan 0,25 gram Coomasie Brilliant Blue,
112,5 mL metanol, 112,5 mL aquades dan 25 mL asam asetat glasial.
b) Larutan
destaining 500 mL dibuat dengan mencampurkan 50 mL metanol, 50 mL asam asetat
glasial dan 400 mL aquades.
Selanjutnya gel
direndam di dalam 20 mL larutan staining solution sambil digoyang selama 20
menit, kemudian larutan staining dituang kembali lewadahnya. Kemudian gel
direndam dalam larutan destaining selama 20 menit dan dicuci selama 3x.
VI. HASIL PERCOBAAN.
50 mL sampel protein + 2,5 mL bradford dicampur menjadi
warna biru tua dan diukur dalam spektovisible 0,645 A 595 hm
Perbandingan 1:5
Sampel: sampel buffer.
Dibuat 4 larutan
1. Tabung berisi susu.
2. Tabung berisi susu.
3. Tabung berisi susu.
4. Tabung berisi nira.
Keempat tabung dipanaskan dimasukkan pada
kolom pada elektroforesis 20 Ma dibiarkanselama
½ jam. Hasil dalam gel
dicuci dengan larutan desteaning. Didiamkan selama 5 menit
VII. PEMBAHASAN
Dari pengamatan yang kami lakukan, cara kerja metode
elktroforesis adalah sebagai berikut:
1. Ektraksi enzim
Setelah sampel dibersihkan ditempatkan didalam mortal dan
diberi pengestrak sebanyak ± 200 (tergantung dari banyaknya, sedikitnya sampel
atau besar kecilnya sampel) kemudian smpel digerus hingga halus. Penggerusan
dilakukan pada kondisi dingin (± 4 0C) dan dilakukan didalam meja pendingin.
Agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan kedalam tabung
eppendrof dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 20
menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan yang selanjutnya
dimasukkan dalam tabung eppendof yang disimpan dalam lemari pendingin (freezer)
dalam suhu sekitar 70 0C.
2. Pembuatan gel
Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang
khusus digunakan untuk elktroforesis pada erlenmeyer, kemudian di cetak pada
cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam
pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai,
karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan
3. Penempatan sampel
Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris
keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat
sumuran dengan cetakan khusus kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah
katoda yang sebagai penyimpan ekstrak enzim. Ekstar enzim yang akan diuji
dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan
ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15
mm ke ekstrak enzim atau dengan pipt mikro. Potongan kertas saring yang telah
berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel.
Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indicator adanya pergerakan maka celah
irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.
4. Proses Elektroforesis
Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal
diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses
ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi
spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan
anatar larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan
plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elekrofororsis
dijalankan dengan member daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik
disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50-70 A, 50-60
A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam. Setelah terlihat bahwa biru brom
fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses
elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan
potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal
dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa
lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik,
untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.
5. Visualisasi sistem enzim
Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan
komposisi yang telah ditentukan sebelumnya. Atau dapat pula dilakukan dengan
pancaran sinar Ultraviolet.
6. Metode Analisis
Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari
elektroforosis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti.
Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita
(bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua
tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel
yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yang ada dalam suatu populasi.
VIII. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan :
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul
bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan
listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis
dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).
Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks
penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus
listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks
penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis
yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE =
polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan
komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam
suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi
keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.
Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah: 1)
Ektraksi enzim, 2) Pembuatan gel, 3) Penempatan sampel, 4) Proses
Elektroforesis, 5) Visualisasi system enzim dan 6) Metode Analisis.
Saran :
Saran pada praktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum
dilakukan oleh praktikan sendiri dan dilkukan proses elektroforesis yang
sebenarnya supaya praktikan lebih mengetahui cara menggunakan metode
elektroforesis.
