ENZIM PENCERNA KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah hasil alam yang melakukan banyak fungsi penting dalam tanaman maupun hewan. Karbohidrat didefinisikan sebagai polihidroksialdehida, polihidroksiketon atau senyawa yang menghasilkan senyawaan yang serupa pada hidrolisis. Dengan demikian, kimia karbohidrat adalah gabungan antara kimia dua gugus fungsi, gugus hidroksil dan gugus karbonil.

Pati terdiri dari molekul-molekul glukosa yang dihubungkan oleh ikatan 1,4. Ikatan ini dapat dengan mudah dihidrolisis menjadi monosakarida. Glikogen juga merupakan polisakarida, namun tidak seperti pati, glikogen mempunyai banyak cabang. Beberapa satuan gulanya mempunyai ikatan 1,4 dan 1,6 yang membentuk cabang.

Penentuan bobot molekul menunjukkan bahwa molekul pati mengandung 200 sampai 3000 satuan glukosa per molekul. Bobot molekul selulosa lebih sulit untuk dipastikan. Namun perkirakan terbaik menunjukkan bahwa banyaknya satuan glukosa per molekul adalah dalam order beberapa ribu.

Selulosa tersusun dari ikatan-β yang tidak dapat diputus oleh enzim manusia ; terdiri dari D-glukosa yang memiliki ikatan-β. Konformasi ini menguntungkan dari segi energi gula-gula berada dalam kursi dan gugus-gugus yang besarnya pada posisi ekuatorial. Glukosamina adalah karbon nomor 1 yang berikatan dengan suatu amina. Contohnya termasuk nukleotida yang mengikatkan ribosa dan deoksiribosa dengan basa (RNA, DNA).

Terdapat sekurangnya 2 beda penting, dalam struktur molekul pati dan selulosa. Dalam selulosa, satuan glukosa dilekatkan ujung ke ujung untuk membentuk molekul mirip kawat panjang. Dalam pati, satuan-satuan ini umumnya dihubungkan dalam suatu pola rantai bercabang, meskipun molekul-molekul tak bercabang yang lebih kecil terdapat dalam kebanyakan pati, dalam jumlah yang beraneka misalnya, pati dari kentang mengandung sekitar 20 % tipe tak bercabang.

Air liur atau saliva disekresikan oleh tiga pasang air liur yaitu kelenjar parotis dibawah telinga, kelenjar submaksilaris dibawah rahang bawah, dan kelenjar sublingual di bawah lidah. Cairan ini terdiri dari kira-kira 99,5 % air dan 0,5 % benda padat. Dua pertiga benda padat terdiri dari bahan organik terutama, ptialin dan musin. Benda padat lainnya ialah ion-ion anorganik seperti SO₄^2-, PO₄^3-, HCO₃^-, Cl^-, Ca²⁺, Na⁺, dan K⁺. Musin dalam air liur berfungsi sebagai pelicin rongga mulut dan membasahi makanan sewaktu makanan dikunyah sehingga mudah ditelan. Ptialin ialah nama lain dari amilase saliva yang akan menghidrolisis pati menjadi dekstrin-dekstrin dan maltosa. Amilase saliva ini tidak aktif pada pH 4 atau lebih rengah lagi. Air liur biasanya ber-pH sekitar 6,8.

α-amilase saliva hanya mengkatalisa hidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik, baik yang terdapat dalam molekul glikogen maupun pati. Hal ini dibuktikan dengan hanya didapatkan 20–30 % hasil hidrolisis yang bergugus reduksi pada aktivitas total enzim, karena masih terdapatnya fragmen-fragmen dekstrin yang berikatan α-1,6-glikosidik.

Dalam hidrolisis pati secara enzimatis, ikatan-ikatan glukosida dari amilosa dan amilopektin diputus sehingga dihasilkan glukosa, maltosa, atau oligosakarida. Produk akhir yang akan dihasilkan bergantung pada jenis enzim yang digunakan. Secara umum, enzim yang digunakan untuk hidrolisis pati dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim memecah satu molekul pati menjadi dua molekul secara acak, sedangkan eksoenzim memutuskan ikatan glukosida pati dari ujung nonpereduksi menjadi monosakarida atau disakarida. Sebagai contoh, jika menggunakan a-amilase (endoenzim) dan glukoamilase (eksoenzim) maka produk akhir hidrolisis adalah glukosa

Pati dalam suasana asam bila dipanaskan akan terhidrolisis menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Hasil hidrolisis dapat diuji dengan iodium dan menghasilkan warna biru sampai tidak berwarna. Hasil akhir hidrolisis ditegaskan dengan uji Benedict.

Hidrolisis dari pati secara berangsur-angsur mengurangi ukuran molekul. Secara serempak, terpisah menjadi glukosa atau maltose dan reaksinya ditunjukkan dengan perubahan warna iodine.

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis pertama kali dicetuskan oleh virologiwan yang bernama Vin Thorne dari Institut Virologi Glasgow. Thorne tertarik untuk menemukan cara yang paling efektif dalam analisis hasil amplifikasi DNA. Thorne beranggapan bahwa sumber listrik mampu memisahkan molekul-molekul DNA berdasarkan ukurannya. Hal tersebut didasarkan juga pada sifat DNA yang bemuatan negatif. Thorne berhasil memisahkan superhelical nicked dan bentuk linear dari DNA poliomavirus dengan menggunakan gel agar.

Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis. 

  Dasar elekroforesis adalah pembentukkan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-seyawa yang telah terpisah  tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.

Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.

Elektroforesis memisahkan makromolekul berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel akan memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer.

2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis RNA pada ukuran standar.

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:

1.      Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.K

2.      Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3.      Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan.

ü  Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein.

ü  Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4.      Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.

5.      Kekuatan voltase

1.      Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

2.      Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak-balik).

6.  Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperature tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.